非洲猪瘟病毒微滴数字PCR(ddPCR)方法的建立及应用

被引：41

作者：

邬旭龙 ^{[1
]}

肖璐 ^{[2
]}

宋勇 ^{[3
]}

林华 ^{[4
]}

陈世界 ^{[4
]}

杨苗 ^{[4
]}

安微 ^{[4
]}

姚学萍 ^{[1
,5
]}

杨泽晓 ^{[1
,5
]}

王印 ^{[1
,5
]}

机构：

[1] 四川农业大学动物医学院动物检疫实验室

[2] 四川省畜牧科学研究院

[3] 天津瑞普生物技术股份有限公司

[4] 四川出入境检验检疫局检验检疫技术中心

[5] 四川农业大学动物疫病与人类健康四川省重点实验室

来源：

微生物学通报 | 2017年 / 44卷 / 12期

关键词：

微滴数字PCR; 实时荧光定量PCR; 非洲猪瘟病毒; 诊断调查;

D O I：

10.13344/j.microbiol.china.170502

中图分类号：

S852.65 [家畜病毒学];

学科分类号：

摘要：

【目的】非洲猪瘟病毒(African swine fever virus,ASFV)能导致猪群高死亡率,从而造成严重的经济损失。因此,建立严密、高效的防控系统,包括灵敏、准确的诊断方法以及高效的预报预警机制等,以避免ASF传入我国。本文旨在建立一种新型而高灵敏度的ASFV微滴数字PCR(Droplet digital PCR,dd PCR)检测方法。【方法】针对ASFV K205R基因设计一对特异性引物和Taq Man探针,通过反应条件优化,建立了ASFV实时荧光定量PCR(q PCR)和dd PCR检测方法;并对两种方法的线性关系、灵敏性、特异性和重复性进行了评估,利用建立的ASFV检测方法对163份国内和进境的组织样本及血清样本进行检测,血清样本经商品化ASFV ELISA试剂盒复检,评估不同方法检测结果的符合率。【结果】建立的ASFV q PCR和dd PCR检测方法线性关系较好(R2≥0.998),dd PCR的最低检测限度可达到0.36拷贝,在20μL反应体系中约为10拷贝/反应,检测灵敏度是q PCR的10倍。ASFV dd PCR检测方法具有很高的特异性和重复性,不与其他猪常见病毒发生交叉反应。【结论】该方法灵敏度高、特异性强,可作为一种有效的分子生物学方法来诊断ASFV,为防止该病传入我国以及ASFV的实时监测提供新的技术储备,同时促进dd PCR技术在我国的发展和应用。

引用

页码：2839 / 2846

页数：8

共 15 条

[1]

非洲猪瘟病毒实验室诊断技术研究及试剂储备.[D].张鑫宇.扬州大学.2015, 05

[2] 以原核表达的非洲猪瘟病毒pK205R蛋白为包被抗原的间接ELISA抗体检测方法的建立 [J].

邬旭龙 ;

彭彬 ;

姜睿姣 ;

肖璐 ;

王印 ;

姚学萍 ;

杨泽晓 ;

张鹏飞 ;

张博 .

中国预防兽医学报, 2016, 38 (10) :800-803

[3] SD-PMA-ddPCR检测食品中单核细胞增生李斯特氏菌 [J].

王静 ;

刘玉敏 ;

李春喜 ;

赵丽青 ;

秦燕 ;

张慧敏 .

微生物学通报, 2016, 43 (10) :2306-2313

[4] 利用微滴数字PCR分析转基因生物外源基因拷贝数 [J].

姜羽 ;

胡佳莹 ;

杨立桃 .

农业生物技术学报, 2014, 22 (10) :1298-1305

[5] 非洲猪瘟病毒p54基因的原核表达及其抗体的间接ELISA检测方法的建立 [J].

曹琛福 ;

梁云浩 ;

陶虹 ;

花群义 ;

曾少灵 ;

杨俊兴 ;

陈兵 ;

张桂红 ;

吕建强 .

动物医学进展, 2014, 35 (02) :6-10

[6] 非洲猪瘟流行病学研究进展 [J].

包静月 ;

王志亮 .

中国动物检疫, 2013, 30 (06) :72-76

[7] 非洲猪瘟病毒实时荧光定量PCR检测方法的建立及应用 [J].

李洪利 ;

曹金山 ;

王君玮 ;

张维 .

中国畜牧兽医, 2012, 39 (06) :37-40

[8] 非洲猪瘟流行病学和诊断方法的研究进展 [J].

王华 ;

王君玮 ;

徐天刚 ;

王志亮 .

中国兽医科学, 2008, (06) :544-548

[9]

外来动物疫病.[M].林祥梅;韩雪清;王景林.科学出版社.2014,

[10]

Optimization of digital droplet polymerase chain reaction for quantification of genetically modified organisms.[J].Lars Gerdes;Azuka Iwobi;Ulrich Busch;Sven Pecoraro.Biomolecular Detection and Quantification.2016, C

← 1 2 →