苦丁茶是一种纯天然植物代用茶,富含三萜及其皂苷类、黄酮、氨基酸等活性物质,具有抗氧化、降脂、抗炎杀菌、减肥、降血压等多种药理功能。在我国,主要的苦丁茶是利用冬青科树叶加工而成的苦丁茶和利用木犀科树叶加工而成的苦丁茶,而前者主要有苦丁茶冬青和大叶冬青。近年来,已有人对冬青苦丁茶的化学成分和药理作用作了一些研究,但研究多集中在粗提物药理作用及其机制的研究上,化学成分研究仅限于三萜及其皂苷类、黄酮类的研究。因此,本研究以苦丁茶冬青苦丁茶和大叶冬青苦丁茶(两者通称为冬青苦丁茶)为原料,较为系统地研究其多酚类物质的测定方法、提取、纯化、结构鉴定和抗氧化活性,同时采取热水提取与醇沉制备冬青苦丁茶多糖,利用层析技术对其进行分离纯化,并对冬青苦丁茶粗多糖及其纯化组分的基本理化性质、体外抗氧化活性进行分析。
1.冬青苦丁茶多酚含量的测定及其抗氧化活性
以绿原酸为标准品,建立了测定冬青苦丁茶中多酚含量的Folin-Ciocalteu比色法。结果表明,苦丁茶提取液在Folin-Ciocalteu试剂3.0 ml、饱和Na2CO3溶液4.5ml、反应温度30℃、反应时间30 min的条件下,测定其747nm处的吸光值,多酚浓度在20.0～100.0 mg/L范围内与吸光值呈良好的线性关系；稳定性、精密度、重现性和回收率实验的相对标准偏差为0.887～1.416%；与酒石酸亚铁比色法的测定结果无显著差异。
苦丁茶冬青苦丁茶热水提取物(粗提物)经不同的有机溶剂分部萃取,得到氯仿萃取物、乙酸乙酯萃取物、正丁醇萃取物及萃取剩余物,然后采用Folin-Ciocalteu比色法测定粗提物和各萃取物的多酚含量,同时应用DPPH法、TEAC法和FRAP法分别测定粗提物和各萃取物的自由基清除能力和还原Fe3+能力。结果表明,苦丁茶提取物具有较高的多酚含量和较强的抗氧化能力,DPPH法和FRAP法测定各提取物抗氧化能力的结果为乙酸乙酯萃取物>正丁醇萃取物>粗提物>萃取剩余物>氯仿萃取物,TEAC法测定结果为乙酸乙酯萃取物>正丁醇萃取物>粗提物>氯仿萃取物>萃取剩余物；多酚含量与抗氧化能力之间、所用抗氧化测定方法之间均存在较好的相关性。
比较了苦丁茶冬青苦丁茶和大叶冬青苦丁茶提取液中多酚、黄酮的含量及体外抗氧化能力,结果表明多酚含量较高的苦丁茶冬青苦丁茶比黄酮含量高的大叶冬青苦丁茶具有较高的体外抗氧化能力。对五种体外抗氧化活性评价方法之间的相关性进行了分析,结果表明各抗氧化方法间相关性良好(R>0.8478),尤以DPPH法与ABTS法的相关性最高(R 0.9967)。
2.冬青苦丁茶多酚提取条件的优化
提取溶剂甲醇、乙醇和水对苦丁茶多酚的提取有显著的影响,提取物的多酚含量随提取溶剂的不同而不同,甲醇、乙醇和水三者之间提取物多酚含量差异显著(P<0.05),这三者中乙醇的提取效果最好。
选择乙醇浓度、提取温度和提取时间3个因素分别进行实验,比较提取物的多酚含量,确定了各因素在CCD实验中的取值中心点,即乙醇浓度、提取温度和提取时间分别是70%、70℃和60 min。在单因素实验基础上,以提取物的多酚含量和清除DPPH自由基能力IC50值为响应值,利用Design-Expert软件对乙醇浓度、提取温度及提取时间3个参数进行三因素三水平的CCD实验,对3个参数的实验组合进行优化。获得的最优提取条件为：乙醇浓度70.5%、提取温度73.9℃和提取时间61.2 mmin的条件下可以得到最高的多酚含量(235.24 mg CHA/gDW);乙醇浓度70.2%、提取温度70.6℃和提取时间60.4 min时可以获得最大的DPPH自由基清除能力(IC50,480.87μg/mL)。可以看出,两组优化条件基本一致,说明可以用相同的提取条件获得最优的多酚含量和抗氧化能力的苦丁茶提取物。
用水为提取溶剂时,提取温度和提取时间2个因素对苦丁茶多酚的提取有显著的影响。通过实验优化,得到了苦丁茶多酚的最优提取条件为：提取温度91.2℃和时间36.1 min,提取物总酚含量达198.45 mg CHA/gDW;提取温度92.2℃和35.7 min,提取物清除DPPH自由基能力最强(IC50,744.74μg/mL)。同样,两组优化条件基本一致,说明以水为提取溶剂时可以用相同的提取条件获得最优的总多酚含量和抗氧化能力的苦丁茶提取物。
选用5次优化的提取条件和5次随机设定的提取条件,对模型方程的适用性进行验证。结果表明,验证性实验的实验值与模型方程的预测值间存在很好的一致性,说明优化出的提取条件是切实可行的。
3.苦丁茶冬青苦丁茶中多酚的分离纯化与结构解析
利用HPLC-DAD分析了冬青苦丁茶、女贞苦丁茶与绿茶(雨花茶)的多酚类化合物组成,结果表明它们的色谱峰图呈现明显的不一致,这说明苦丁茶的主要化学成分可能不同于绿茶,苦丁茶冬青苦丁茶和女贞苦丁茶的组成可能也不一样。
通过HPLC-MS知HPLC-DAD分析,结合茶叶儿茶素[(-)-EC、(-)-ECG、(-)-EGC知(-)-EGCG]、没食子酸、咖啡碱、茶叶碱和可可碱的标准样叠加分析验证,绿茶的主要多酚类成分为没食子酸、没食子酰基奎尼酸、EC、(-)-EGC、(-)-EGCG。根据苦丁茶冬青苦丁茶的HPLC-MS分析结果与相关参考文献,推测其主要多酚类化合物为绿原酸及其衍生物,即3-咖啡酰基奎尼酸、绿原酸、4-咖啡酰基奎尼酸、3,4-二咖啡酰基奎尼酸、3,5-二咖啡酰基奎尼酸和4,5-二咖啡酰基奎尼酸。而根据女贞苦丁茶的HPLC-MS分析结果,认为女贞苦丁茶的主要酚类化合物为苯乙醇苷类成分,即紫茎女贞苷A、Ligurobustoside N、紫茎女贞苷C、紫茎女贞苷B和Osmanthuside B6。
利用半制备型HPLC从苦丁茶冬青苦丁茶中分离纯化得到5种单体化合物,通过MS和NMR分析结合]3PLC-DAD、HPLC-MS的分析结果,将5种单体化合物分别鉴定为羟基酪醇葡萄糖苷(hydroxytyrosol glucoside)、绿原酸、4,5-0-二咖啡酰奎尼酸、3,5-O-二咖啡酰奎尼酸和3,4-O-二咖啡酰奎尼酸,其中化合物1是首次从苦丁茶冬青苦丁茶中分离得到。
4.大叶冬青苦丁茶多糖提取、纯化与抗氧化活性
大叶冬青苦丁茶经热水提取、脱色、醇沉、干燥,得到大叶冬青苦丁茶粗多糖(ILPS).粗ILPS经DEAE-52纤维素层析柱分离得到四个多糖组分,即ILPS-1、ILPS-2、ILPS-3知ILPS-4.红外光谱分析表明粗ILPS及其纯化组分均是多糖类物质,粗ILPS与各纯化组分的蛋白质、糖醛酸和硫酸基含量存在很大的差异,粗ILPS. ILPS-1、ILPS-2知ILPS-3主要由鼠李糖、阿拉伯糖和半乳糖等组成。
采用化学法分别测定了粗ILPS及其纯化组分的体外清除自由基(DPPH-O2-、·OH)能力、还原能力以及螯合金属能力。结果表明,大叶冬青苦丁茶多糖具有较强的体外抗氧化活性,并且抗氧化能力与多糖浓度之间存在良好的相关性。
