大豆异黄酮糖苷的超临界流体萃取及固定化酶转化研究

大豆异黄酮是在大豆生长过程中形成的一类具有重要生理功能的次生代谢产物。大豆异黄酮共有12种异构体,包括染料木素、大豆苷元、黄豆黄素3种游离型的苷元和各苷元与葡萄糖基、乙酰葡萄糖基、丙二酰葡萄糖基结合的9种糖苷。大豆中糖苷的比例可达到97%-98%,而苷元只占2%-3%。大豆异黄酮糖苷须转化成苷元才能被机体吸收,发挥其生理活性作用。本论文采用超临界CO2流体萃取法对脱脂豆粕中异黄酮糖苷染料木苷进行提取,并通过固定化β-葡萄糖苷酶催化染料木苷转化为染料木素活性苷元进行了研究,主要结果如下: 1、通过单因素试验和正交试验,获得的超临界CO2流体萃取脱脂豆粕中染料木苷的优化工艺条件是:乙醇用量300 mL/100 g脱脂豆粕,萃取温度55℃,萃取压力30 MPa,静萃取时间120 min,动萃取时间60 min。该工艺条件下染料木苷的萃取率为794.5μg/g。通过借鉴固定床吸附/脱吸附传质理论,采用BP神经网络,建立了超临界流体萃取染料木苷的动力学模型,拟合了实验条件下的超临界萃取动力学曲线,网络训练误差和预测误差分别为1.8%和3.7%,模拟所得kLa与实验结果值的误差约为9%;确定参数后的动力学模型可较为精确地定量描述萃取床层的溶质浓度分布。 2、通过对豆科蝶形花亚科中异黄酮含量较高的大豆等32种植物萌发种子和黑曲霉等32株微生物β-葡萄糖苷酶催化染料木苷转化为染料木素的活性筛选,发现黑曲霉5-12的β-葡萄糖苷酶酶活力最大（633.76 U/mg蛋白）。分离纯化和酶学性质研究结果表明,该黑曲霉β-葡萄糖苷酶分子量约为151.7 KDa,含2个亚基;分子结构由α-螺旋7.1%、β-折叠49.0%、转角21.7%和无规卷曲22.2%组成;具有较高的热稳定性、pH稳定性和贮藏稳定性。 3、正交试验和三因素二次通用旋转组合试验优化出黑曲霉5-12在5L发酵罐中发酵生产β-葡萄糖苷酶的适宜培养工艺和培养基,优化培养工艺是:转速400 r/min,温度30℃,接种量10%,优化培养基（g/L）是:麦麸28.4,（NH4）2SO4 1.2,KH2PO4 2.0。黑曲霉5-12在优化的产酶条件下发酵3天,发酵液中β-葡萄糖苷酶的酶活达到1493.90 U/mL。其细胞生长模型符合Monod方程,产酶动力学符合Luedeking-Piret方程。利用黑曲霉5-12细胞能够形成聚集体的特性,建立了黑曲霉5-12无载体固定化发酵β-葡萄糖苷酶的培养体系。 4、以海藻酸钠为载体,采用交联-包埋法,实现了β-葡萄糖苷酶的有效固定化。与游离酶相比,固定化酶最适温度、最适pH值和Km值分别由50℃、4.5和2.99μg/mL下降到40℃、4.0和2.02μg/mL,具有更强的耐酸性和稳定性。该固定化酶用于催化大豆异黄酮染料木苷转化活性苷元染料木素,染料木苷转化率达100%,重复使用8次后,转化率保持75%以上。 5、以磁性纳米氮化铝颗粒为载体,以戊二醛为交联剂,在20℃、pH5.0、100 r/min下作用3.5 h后,制备了固定化β-葡萄糖苷酶。扫描电镜、红外光谱、差热分析表征了纳米颗粒固定化酶的结构特征。与游离酶相比,磁性纳米氮化铝颗粒固定化酶最适温度、最适pH值和Km值分别由50℃、45和2.99μg/mL上升为55℃、5.0和6.41μg/mL,具有良好的贮存稳定性和操作稳定性。该固定化酶用于催化大豆异黄酮染料木苷转化活性苷元染料木素,染料木苷转化率达88%,重复使用8次后,转化率保持50%以上。与海藻酸钠固定化酶比较,磁性纳米氮化铝颗粒固定化酶对底物亲和力和染料木苷转化率稍有降低,但在外加磁场的作用下,磁性纳米氮化铝颗粒固定化酶可定向移动,有利于酶和产物的快速分离。